原花青素抑制脂多糖激活神经小胶质细胞的机制
原花青素(proanthocyanidin,PC)是一类黄烷醇单体及其聚合体形成的多酚类化合物,广泛存在于水果、蔬菜、树皮中。原花青素生物学功能丰富,具有较强的抗氧化和清除自由基 [1]、 抗炎 [2]、 神经保护 [3]等功能,且其在人体内的生物活性很高,作用安全可靠,广泛应用于食品、保健、医疗等领域。
小胶质细胞是中枢神经系统中一类固有免疫细胞。当大脑受到外界环境刺激时,静息的小胶质细胞会被迅速激活,持续释放肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)、一氧化氮等细胞毒性分子,引发神经炎症反应并损伤周围神经元。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性杆菌胞壁外膜层的重要组分[4]。
Toll样受体(Toll like receptor,TLR)是一类天然免疫受体,在小胶质细胞中表达较为广泛。其中TLR4作为TLR家族中的重要成员,是介导脂多糖应答的最主要受体。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路之一,在炎症反应和众多神经退行性疾病中发挥重要作用。研究表明,LPS刺激小胶质细胞可引起TLR4/p38 MAPK信号通路的活化并释放炎性细胞因子 [5]。目前原花青素的研究主要集中于抑制小胶质细胞活化产生促炎性因子的形态学研究上 [6],缺乏机制学研究。本研究利用LPS激活小鼠小胶质细胞(BV2细胞)构建体外炎症模型,原花青素进行干预,探讨原花青素抑制LPS激活 BV2细胞的相关机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
BV2细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心;原花青素,购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;LPS(E. coli O55:B5)、四甲基噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)均购自Sigma公司;DMEM高糖培养基购于HyClone公司;胎牛血清购自Clarkbio公司;0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液购自Gibco公司;NO检测试剂盒(S0021)、BCA蛋白浓度试剂盒(P0010)购自上海碧云天生物技术有限公司;TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒均购于南京森贝伽生物科技有限公司;TLR4、p38、p-p38及actin一抗和二抗、免疫印迹化学发光试剂盒均购自Santa Cruz公司。
6.融入社会责任。开展“党旗领航·和谐共创”行动,围绕“爱心·宝胜”主题,群团部门相继开展“5.19慈善一日捐”、无偿献血、爱心帮扶、心灵驿站排忧解难等活动,创新救助帮扶机制和服务群众措施。
1.3.1 细胞培养 BV2细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM高糖完全培养基,于CO2体积分数5%的37 ℃恒温培养箱中培养。每天更换1次培养基,每2~3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。
1.2 主要仪器
ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度的结果如表1所示。与对照组相比,LPS(1.0 μg/mL)处理BV2细胞后TNF-α、IL-1β和IL-6的释放水平明显增加(p<0.05)。与1.0 μg/mL LPS组相比,不同浓度(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)的原花青素预处理使TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度显著降低且呈剂量-效应关系(r值依次为0.735,0.604,0.736,P均<0.05)。
采用Western blot法检测原花青素对TLR4受体表达水平的影响,结果如图4所示。与对照组相比,LPS刺激BV2细胞后TLR4蛋白表达显著升高(p<0.05)。与1.0 μg/mL LPS处理组相比,原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)干预BV2细胞后,TLR4蛋白表达水平下调且呈剂量-效应关系(r=0.732,p<0.05)。
1.3 实验方法
单因素试验数据处理使用Excel 2016、Origin 8.5软件进行,差异显著性分析使用DPS 9.5软件进行,P<0.05有统计学意义,中心组合法试验数据处理使用Design Expert 8.0.5 软件进行。
如图2所示。与对照组相比,0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL原花青素单独作用或与1.0 μg/mL的LPS共同作用,对BV2细胞存活率的影响差异均无统计学意义(P>0.05)。该结果表明在实验所用剂量范围内,原花青素对静息状态或1.0 μg/mL LPS激活状态下的BV2细胞未产生毒性作用。
1.3.2 Griess法测定NO水平 LPS诱导BV2细胞活化,构建体外炎症损伤模型。BV2细胞以1×105/mL 的密度接种于24孔板,每孔800 μL。待细胞贴壁后,设立对照组 、 LPS(0.01、0.1、 1.0、10.0和20.0 μg/mL)组。LPS刺激BV2细胞24 h后收集细胞上清,按试剂盒说明书操作,测定吸光度D(540)值。样品中NO含量根据标准曲线计算,由此确定并验证LPS的造模浓度。
1.3.3 MTT法检测细胞活性 BV2细胞以1×104/mL的密度接种于96孔板,每孔100 μL。待细胞贴壁后,设调零组、对照组、LPS(1.0 μg/mL)组、原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)组、LPS(1.0 μg/mL)+原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)组。调零组不含细胞,对照组细胞正常培养,原花青素比LPS预先1 h加入。孵育24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL,继续孵育4 h后,吸弃培养基,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min,酶标仪测定吸光度D(570)值,计算各组细胞存活率。
1.3.4 ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6水平 BV2细胞以5×104/mL的密度接种于24孔板中,每孔500 μL。待细胞贴壁后,设对照组、1.0 μg/mL LPS组和1.0 μg/mL LPS+不同浓度(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)原花青素组,孵育24 h后收集上清。具体操作按照ELISA试剂盒说明书进行,酶标仪测定吸光度D(450)值。样品中TNF-α、IL-1β、IL-6含量根据各自的标准曲线计算。
近年来神经免疫炎症机制在神经退行性疾病中的作用受到普遍关注。小胶质细胞作为中枢神经系统中最重要的固有免疫细胞,是神经炎症的重要参与者,在大脑的炎症反应中起最为关键的作用 [7]。当大脑受到外界环境刺激时,静息的小胶质细胞会被迅速激活为“阿米巴样”,持续释放肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、一氧化氮等炎症介质,还可释放活性氧、谷氨酸、趋化细胞因子等细胞毒性分子,这些细胞因子大量累积可导致局部细胞生存环境恶化,引发神经炎症反应并损伤周围神经元 [8]。受损的神经元反过来又会进一步诱导小胶质细胞的活化,从而形成一个恶性循环的病理过程,导致神经退行性病变持续进展。因此,抑制小胶质细胞的活化有望成为缓解帕金森病等神经退行性疾病进程的有效手段。
1.4 统计学方法
实验结果以表示,用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析。先采用Levene法检验总体方差齐性,若方差齐(P>0.05),采用LSD检验;若方差不齐(p<0.05),则采用Dunnett’s T3检验,α=0.05为检验水准。
2 结 果
2.1 LPS诱导BV2细胞炎症损伤模型的建立
不同浓度LPS对BV2细胞释放NO影响的结果如图1所示。与对照组相比,0.1、1.0、10.0、20.0 μg/mL LPS均可增加BV2释放NO水平(p<0.05),且随LPS浓度增大而增加。为确保炎症损伤模型建模成功,同时减少LPS对细胞不良影响,结合文献选择1.0 μg/mL LPS染毒BV2细胞进行后续实验。
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图1 不同浓度LPS对BV2细胞释放NO的影响
2.2 原花青素及LPS对BV2细胞活性的影响
根据力学原理,当相同轴型的货车所装载货物的总重在一定范围内时,其各轴重占总重的百分比符合一定的规律。当车辆通过收费站的车道时,收费系统的计重设备会记录其轴型和轴重信息。通过对收费数据库中的海量数据进行轴型和超限比例分析,运用机器学习算法计算各组轴重分布的均值,得到货车载荷数据分布的隐含规律和不同类型货车对应轴型的分布情况。以此为依据,对通行记录进行分析和判别,找出异常记录,从而识别出假轴车辆,有效避免车辆通行费流失。
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图2 原花青素及LPS对BV2细胞活性的影响
2.3 原花青素抑制LPS激活BV2细胞释放炎性因子
Series 8000恒温培养箱购自Thermo Scientific公司,IX51倒置显微镜购自Olympus公司,5417R高速冷冻离心机购自Eppendorf AG公司,RT-6000酶标分析仪购自Rayto公司。
表1 原花青素对LPS诱导BV2细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6的影响(s)
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与对照组比较,*p<0.05;与1.0 μg/mL LPS组比较,#p<0.05.
组别 TNF-α/(ng/L)IL-1β/(ng/L) IL-6/(pg/mL)对照组 #257.1±17.9 #77.2±12.5 #85.3±10.8 1.0 μg/mL LPS组 *665.4±90.1 *143.0±8.6 *157.3±29.3 LPS+0.1 μg/mL PC组 #128.0±11.5 LPS+0.5 μg/mL PC组 #*506.6±85.4 #*120.2±13.8 #**429.0±44.6 #*108.0±16.2 117.5±11.2*#LPS+2.5 μg/mL PC组 #368.5±69.4 #103.7±15.2 #103.7±11.1*LPS+10 μg/mL PC组 #289.3±66.8 #91.8±6.5 #91.9±12.1
2.4 原花青素对LPS诱导BV2细胞p38蛋白磷酸化的影响
采用Western blot法检测原花青素对p38 MAPK通路的影响,结果如图3所示。与对照组比较,给予LPS(1.0 μg/mL)刺激,BV2细胞p-p38蛋白表达升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。与1.0 μg/mL LPS组相比,原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)预处理BV2细胞,p-p38蛋白表达下调(p<0.05),且磷酸化水平呈剂量依赖性降低(r=0.710,p<0.05)。
而浙江省气象台此前使用的省级海洋业务平台因为开发应用多年,且主要功能以多种产品显示为主,不具有GIS缩放、格点订正等功能,无法很好展示近年来发展的海洋气象客观预报产品的精细化程度,已不能满足现代化海洋预报业务的需求。为此,省气象台及时组织力量开发新一代省级海洋预报业务平台。新一代海洋预报业务平台是立足于为全省气象预报员服务,基于海洋业务扁平化的理念,提供集数据采集、精细分析、格点订正、预报制作、快速发布、产品展示、工作记录等功能于一体,基于Silverlight和SQL数据库技术进行开发的专业业务平台,并将在使用中不断发展来更好满足台风和海洋气象预报业务需求。
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图3 原花青素对LPS诱导BV2细胞p38蛋白磷酸化的影响
2.5 原花青素对LPS诱导BV2细胞TLR4蛋白表达的影响
(三)具有损害事实。所谓损害事实指的是侵权行为人给受害人造成不利的后果,包括财产的损害、人身损害和精神损害。第三人干扰婚姻关系的行为侵害配偶权的同时,不可避免的会对无过错一方的情感带来巨大的伤害,从而造成不同程度的精神损害,严重者因无法承受而选择自杀或伤害自身的行为。在特定况下由配偶身份而衍生出相关的财产权、继承权也会受到侵犯。〔5〕
3 讨论
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图4 原花青素对LPS诱导BV2细胞TLR4蛋白表达的影响
1.3.5 Western blot检测 BV2细胞以每皿1×106个接种于6 cm培养皿中,分组同1.3.4。PC提前1 h加入,加入LPS作用1 h后,收集细胞,用RIPA裂解液提取蛋白。高速低温离心机4 ℃、12 000 g离心5 min,取上清液,以碧云天BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白含量进行测定。取适量蛋白进行凝胶电泳、转膜、封闭,一抗4℃封闭过夜。TBST洗膜8次,每次5 min。二抗室温孵育2 h,TBST再次洗膜8次,每次5 min。然后加入免疫印迹化学发光剂进行显影、定影,并用Image J软件对成像结果进行分析。
本研究首先利用LPS建立体外炎症模型,通过Griess法测定NO浓度选定LPS 1 μg/mL作为造模浓度,原花青素干预,应用ELISA法检测炎症因子分泌水平,结果表明原花青素可呈剂量依赖性抑制LPS激活BV2细胞释放的TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子。因此,原花青素可对小胶质细胞活化引起的炎症因子分泌水平升高起到一定缓解作用。
在小胶质细胞中,NF-κB信号通路是介导炎症的经典通路。我们前期研究已经证实,原花青素可通过下调转录因子NF-κB的活化,抑制炎症介质的释放,从而抑制小胶质细胞活化 [9]。但NF-κB途径还需要与其他信号通路相互协调作用,比如受MAPK信号通路的调控,共同调节细胞炎症信号级联。
p38 MAPK信号通路是MAPK信号通路中的一条重要通路,与炎性反应调控密切相关。有研究发现LPS等促炎因子刺激可通过激活小胶质细胞中p38 MAPK通路,诱导NF-κB通路激活,引起小胶质细胞活化,从而释放炎性因子 [10-12]。大量文献表明药物通过抑制p38 MAPK信号通路发挥抗炎作用。因此,我们研究在LPS激活的BV2细胞中原花青素是否可以通过抑制p38 MAPK信号通路的磷酸化激活从而发挥其抗神经炎症的作用。本研究证实,LPS显著上调了p38 MAPK的磷酸化水平,而原花青素干预可显著降低p-p38蛋白表达,且随浓度增大抑制作用越明显,说明p38 MAPK信号通路在原花青素抑制脂多糖激活神经小胶质细胞释放炎症因子过程中发挥重要作用,这一结论与相关文献报道一致[13-14]。
老板娘不急,微微一笑,双手一撑柜台,削肩细腰,身体箭一般射出去,在半空中游龙惊鸿似的绕行一圈,芙蓉并蒂、傍花随柳、浮花浪蕊、玉石俱焚、兰摧玉折、钟林毓秀,隐隐指掌,如梦如幻,缓急中节,又稳稳落到柜台里面来。飞绕一圈,腰身婉转,好像鱼游水中,电光石火的工夫,李离他们只见老板娘手指上下翻飞,手腕上的环佩叮当繁响,认穴戳脉的本领,妙到毫巅。一时间,场上争生赴死的十几个人,被她或撞或拉,拂上穴位,麻痒不禁,呆头鹅般停了打斗。
TLR4是引起机体炎症反应的关键分子,在小胶质细胞活化引起的神经炎症反应中至关重要。研究表明LPS可被小胶质细胞膜上TLR4受体识别,触发MAPK[15-16]和 NF-κB [17-18]通路,从而启动促炎因子等多种基因转录及表达。本研究采用Western blot检测表明LPS可显著上调TLR4蛋白表达,原花青素干预BV2细胞后,TLR4蛋白表达较LPS刺激组明显下降,提示原花青素可能通过TLR4通路抑制小胶质细胞活化释放的炎性因子。这一结论与相关文献报道一致[19-20]。
综上所述,原花青素可通过TLR4/p38 MAPK信号通路抑制脂多糖激活神经小胶质细胞,抑制炎症因子的分泌,从而为研究原花青素预防和延缓神经退行性疾病的进展提供了理论依据。
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