红细胞血型基因分型技术在疑难配血中的应用
红细胞血型在临床输血医学、器官移植和法医鉴定等领域中具有重要意义。目前国际输血协会(The International Society of Blood Transfusion,ISBT)已确认了36个红细胞血型系统、300多个血型抗原[1]。临床输血医学领域中最重要的为ABO、Rh、Diego、Duffy、Hh、Kidd和MN等血型系统。目前临床输血只进行ABO血型和RhD血型的同型输注,反复输血的临床患者容易产生ABO和RhD以外的同种抗体,造成配血不合。有些抗体单纯采用谱细胞很难鉴定,需要采用多种方法相结合,鉴定才更准确和更可靠。
材料与方法
1 材料
芜湖卤干子,实乃一绝,咬一口,汁液淋漓,泡泡软软,吸饱了汤汁,筷子夹起颤巍巍的——世间怎么会有如此可口的食物?普通的一块块白干子,改成花刀,入油锅炸至金黄,捞起,放入调好的汤汁中焖煮,越煮越入味。要一碗牛肉面,两块卤干,一顿早餐,铁饱。铁饱这个词,属芜湖方言,大约是胃饱胀得太坚硬了,再也不能吃别的了。夜深,当我们经过新芜路,忽然想起“老凌鸽子汤”,也不知,可还在了。
1.1 病例简介:患者,女,83岁,贫血,多次输血,输注红细胞悬液8U和输注机采血小板总计40 U。
1.2 试剂:DNA提取试剂盒(北京天为时代);Kidd血型基因分型引物合成(TaKaRa公司);GoTaq®Green Master Mix(Promega公司);抗-A、抗-B血型定型试剂,抗-A1、抗-A+B、抗-H血型定型试剂、抗球蛋白和人ABO血型反定型红细胞(上海市血液中心生物医药有限责任公司);凝聚胺试剂(珠海贝索生物技术有限公司);卡式配血试剂(BIORAD)。
3 交叉配血试验 与10例O型RhD阳性献血者血液进行主、次测交叉配合实验,10例在盐水介质中主次侧均相合,9例在凝聚胺、抗人球蛋白和凝胶卡主侧配血不相合,1例在凝聚胺、抗人球蛋白和凝胶卡主、次侧配血无溶血、无凝集,配血相合。
2.2 DNA提取及浓度和纯度检测:采用北京天为时代试剂盒提取,严格按照说明书操作,应用SMA4000微量分光光度计进行浓度和纯度测定
1 血清学检测结果 该患者ABO血型为O型,RhD阳性,直接抗球蛋白实验阴性,抗体筛选阳性。
2 方法
2.3 K i d d血型基因分型:引物参照文献[3]。扩增片段3 0 1 b p,特异扩增人生长激素基因429 bp的引物作为内对照,HGH-s:5'-GCCTT C C C A A C C A T T C C C T T A-3',H G H-a:5'-TCACGGATTTCTGTTGTGTTT -3'。PCR反应总体积10 μl,包括GoTaq® Green Master Mix 5 μl,特异性引物终浓度0.5 μmol/L和样本DNA50 ng。PCR扩增反应程序:95℃预变性5 min;95℃变性30 s,60℃退火60 s,72℃延伸30 s,35个循环;72℃延伸10 min。产物通过2.5%琼脂糖凝胺电泳,以150 V电泳15 min,凝胶紫外成像。
蜂窝汽封与其他各种形式的“硬齿”汽封相比,它的汽封齿最薄,硬度也最低,因此碰磨时不会象其他“硬齿”汽封一样在转子表面留下显著的磨痕。同时,蜂窝汽封与其他“硬齿”汽封不同,在与转子碰磨时象不会产生“刀片”切割现象,这是它不会磨伤转子的主要原因。梳齿类汽封的每一根汽封齿,在与转子碰磨时犹如车刀,很容易在转轴或覆环表面割出沟槽。此外,蜂窝汽封由于它曲折的网状结构使其表面面积大大增加,又极大地提高了它的耐磨性,因此蜂窝汽封既耐磨又不易磨伤转子是它突出的一个特点。
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结 果
2.1 血清学试验:ABO血型鉴定、红细胞血型抗体鉴定及交叉配血按照全国临床检验操作规程[2]进行。
2 红细胞血型抗体鉴定 患者血清与1~10号谱细胞反应,盐水介质中无凝集,抗人球蛋白介质中1、4、5、6、7、8、9和10号凝集,2和3号不凝集。自身细胞不凝集。根据红细胞抗体鉴定原则,可能含有抗-Jkb抗体。在抗球蛋白介质中,患者血清与含有Jk(b+)抗原的红细胞反应,与缺乏Jk(b+)抗原的红细胞不反应。结果见表1。采用间接抗人球蛋白方法检测该抗体效价为4。
南通作为江苏省唯一的江海门户,位于“一带一路”、“长江经济带”、“江苏沿海开发”多重战略叠加区。这给南通带来巨大的发展机遇和潜力。为此,南通市政府亦集思广益,提出了很多有实际意义的发展方案。这同样将给南通物流业,尤其是集装箱运输带来巨大的压力。目前国内外对集装箱多式联运研究很多,大多数集中对某个方面和环节进行研究,缺乏统一的规划。论文从系统论角度对南通发展集装箱多式联运的构成要素节点、集疏运条件、经济腹地三个角度进行调查,探讨集装箱多式联运发展对策。
1.3 仪器:SMA4000微量分光光度计(Merinton)、PE-9700扩增仪(美国ABI公司),DYY-6B型稳压电泳仪(北京六一仪器厂),UVPGDS-8000凝胶成像系统(美国UVP公司)和KUBOTA细胞洗涤离心机(日本)。
民生银行成立后,“民生”成为了泛海系的一个大IP,泛海系正式踏上金融之旅。2002年,泛海收购了河南省内的证券公司黄河证券,更名为民生证券,2014年民生证券注入泛海控股上市公司主体内。
表1 患者血清与10个O型谱细胞反应结果
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序号Rh-hrKiddMNSsDuffyDiegoKellLewisP试验结果DCEceJkaJkbMNSsMur FyaFybDiaDibKkLeaLebP1盐水AHG 1++00+0+++++/+0//0/0+003+2+0++0+00+0+0+00+0+0++00 3++++++00+0+0+++/0/+/+00 4+++++0++00+/+0//0/+++03+5+0+++0+++0+0+00+0+0++03+6+00++0+0+0+0+00+0+0+003+7000++++++0+++00+0++0+02+8+++0+0+++0+/+0//0/0+003+9000++++0+0+0+00+0+0002+10+0++0+++00+/+0//0/0+002+自身00
4 Kidd血型检测 该患者血清中怀疑含有抗-Jkb抗体,需要检测其是否含有Jkb抗原。由于Kidd血型的抗血清较昂贵,平常实验室不常使用,而血清长时间不用效价会降低。采用基因分型技术检测该患者和配血相合献血者的Kidd血型。结果见图1。该患者和配血相合献血者Kidd血型都是Jk(a+b-)型。
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图1 患者Kidd血型的基因分型
注:M:1 000bp分子量标准,1~2为Jk(a+b+)型对照,3~4为Jk(a+b-)型对照,5~6为Jk(a-b+)型对照,7~8为患者Jk(a+b-)型
讨 论
临床输血实践中红细胞血型检测常规使用的血型血清学定型技术,一般是先采用单克隆或多克隆抗体与红细胞凝集试验测定,疑难者再附加吸收放散试验、唾液定型等项目。经典的红细胞血清学血型鉴定技术,无法对红细胞血型进行准确定型,而基因分型技术解决了常规技术无法解决的疑难血型鉴定等问题。从基因水平进行分型,克服了血清学方法易受抗原活性竞争、抗体的特异性及微生物污染等因素影响的缺点,使分型结果更加准确可靠,个体识别能力进一步提高[4]。
有些红细胞抗原检测抗血清昂贵、稀少且不易保存,基因分型是非常必要的。本文采用基因分型技术鉴定患者Kidd血型,进一步确定该患者含有的抗体类型,找出相合献血者输血给这些患者。有时没有合适抗血清可供研究时,就需要对疑似抗体的患者也做基因分型。采用分子生物学实验方法检测基因型准确、成本低,且不易受标本保存期限的影响。
Kidd系统抗体通常为IgG性质,在抗球蛋白介质中反应最佳。有明显的剂量效应[5]。用于筛查患者血清中抗体的谱细胞应选用Jk(a+b-)或Jk(a-b+)细胞,避免剂量效应。Kidd抗体很难被检测到,在检测较弱的抗体时必要时要用酶处理的细胞。通常用抗球蛋白试验来检测Kidd抗体,同时Kidd抗体与大多数血型抗体不同,在人体产生后消失极快,数周或数月后便很难检出,有时还有补体存在。所以要重视检测弱Kidd抗体的重要性[6]。输血前要认真查看患者抗体检查记录、输血史、妊娠史等,避免误输相应抗原阳性细胞而发生溶血性输血反应。
参 考 文 献
1 Patnaik S K,Helmberg W,Blumenfeld O O. NCBI dbRBC database of allelic variations of genes encoding antigens of blood group systems[J]. Nucleic Acids Res,2012,40(1):1023-1029.
2 叶应妩,王毓三,申子瑜,主编.全国临床检验操作规程[M]. 南京:东南大学出版社,2006:257-264.
3 傅启华,何吉,洪小珍,等.浙江汉族Kidd血型基因分型[J].中国输血杂志,2001,14(4):240-241.
4 郑小凡,译. 红细胞多态性的基因分型[J]. 国际输血及血液学杂志,2010,33(5):473-478.
5 李继明,郭一鸣,李蓓,等.抗-Jkb引起新生儿溶血病1例[J].中国输血杂志,2003,16(2):120-121.
6 李世祥,章旭,李剑平. 抗-Jkb引起交叉配血不合1例[J].中国输血杂志,2014,27(2):199-200.
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