RASSF1A 基因甲基化和SCC联合检测在非小细胞肺癌转移监测中的应用
肺癌是否发生转移对于术后的治疗方式和预后有重要的影响,但是目前缺乏可早期、动态监测肺癌转移的标志物。目前多项研究表明,抑癌基因—Ras相关结构域蛋白家族1A(ras association domain family 1A,RASSF1A)的编码基因启动子区的甲基化与肺癌相关[1⁃3]。因此 RASSF1A 基因甲基化有可能作为动态监测肺癌转移的标志物。同时,近几年对于循环肿瘤DNA的研究显示,肿瘤患者血液中游离DNA与相应的原发肿瘤细胞基因变异相一致[2]。因此,循环血中的RASSF1A基因甲基化水平检测也可能成为一种非侵入性的肿瘤诊断手段[3]。鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC)是一种传统的肺癌标志物,可辅助诊断肺鳞癌,配合癌抗原125(cancer antigen 125,CA125)、细胞角蛋白19片段(cytoker⁃atin⁃19⁃fragment,CYFRA21⁃1)、癌胚抗原(carcino embryonic antigen,CEA)联合检测可提高肺癌患者诊断的灵敏性[4],其水平与肿瘤的进展程度相关,但是单独检测灵敏度不高[5⁃6]。本研究通过随访观察非小细胞肺癌(non⁃small cell lung cancer,NSCLC)患者,采用甲基化特异性PCR(methyla⁃tion specific PCR,MSP)技术对NSCLC患者肿瘤组织及对应术前血浆标本中RASSF1A甲基化水平进行检测,并同时检测上述病例术前血清SCC水平,旨在探讨RASSF1A甲基化水平和SCC联合检测在NSCLC患者危险分层及术后转移评估中的价值。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选择2014年1月至2015年6月在龙岩市第二医院就诊的57例NSCLC患者,其中男性25例,年龄35~72岁,平均年龄(65.8±3.9)岁;女性 32例,年龄 30~70岁,平均年龄(59.5±5.6)岁。入选标准:①病理诊断为NSCLC,符合美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)2015年 NSCLC临床指南[7]。②未经任何放化疗等治疗。③无其他肿瘤病史。
1.2 方法
在施行手术前采集患者外周静脉血液标本5 mL,其中2 mL分离血清,3 mL置于经过EDTA⁃Na处理的抗凝管中,3 000 r/min离心15 min,分离血浆。取5~10 g肿瘤组织,肿瘤组织需取自肿块中心且未发生坏死的部分,术后均经病理医生确诊为NSCLC。组织获取均征得患者及家属知情同意,并经医院伦理委员会同意,分别于1个月、3个月、6个月、12个月随访患者因肺癌转移再次入院情况。
1.2.1 血清SCC水平测定
血清SCC水平测定采用电化学发光法,试剂和检测仪器购自美国罗氏公司。实验步骤按照说明书操作。血清SCC水平正常值为:<1.5 ng/mL。
翻转课堂作为新兴的教学模式,其实施必须要能真正激发学生自主学习的兴趣。翻转课堂不仅仅是对传统课堂的颠覆,也能使学生在课下有更多获取知识、自主思考的机会和渠道,更能使课堂上的时间被充分利用,让教学变得更具效率,照顾到更多的学生。但同时,教师也要清楚地认识到,翻转课堂在实施过程中存在困难和挑战,要与传统教学方式中的优势相结合,发挥其特有的效果,解决课程在传统授课中多年存在的问题。
1.2.2 MSP法检测RASSF1A甲基化水平
DNA提取及修饰:取50 mg组织,使用蛋白酶K消化法提取组织DNA,采用DNA纯化试剂盒(QIAGEN,德国)提取血浆样本中的基因组DNA,按试剂盒说明书操作。提取后的DNA用紫外分光光度计(岛津UV⁃1750,日本)测定浓度及纯度。DNA甲基化修饰使用The Intergen CpGenome DNA Modification Kit(QIAGEN,德国),取DNA 1 μg用3 mol/LNaOH处理变性后,再通过亚硫酸氢钠修饰,50℃避光水浴过夜,修饰后的DNA用乙醇沉淀回收并用去离子水重悬,即可用于MSP的检测。
MSP检测:针对RASSF1A基因启动子的转录调控区域,根据参考文献[3]合成基因的各PCR引物,甲基化引物对的上游引物序列为5′⁃GTGTTA⁃ACGCGTTGCGTATC⁃3′,下游引物序列为 5′⁃AACCCCGCGAACTAAAAACGA⁃3′;非甲基化引物对的上游引物序列为5′⁃TTTGGTTGGAGTGT⁃GTTAATGTGT ⁃3′,下游引物序列为5′⁃CAAACCCCACAAACTAAAAACAA⁃3′。
采用SPSS 19.0软件进行统计分析。用χ2检验分别比较不同病理分期患者、鳞癌和非鳞癌患者、发生转移和未发生转移患者组织和血浆中RASSF1A基因甲基化阳性率;t检验分别比较鳞癌和非鳞癌患者、发生转移和未发生转移患者术前血清SCC水平。单因素方差分析法比较不同病理分期患者术前血清SCC水平差异。通过绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteris⁃tic curve,ROC)制定实验数据的截断点,采用Ka⁃plan⁃Meier进行生存分析,生存曲线比较采用Log Rank检验。以上统计学分析以P<0.05为差异具有统计学意义。
比如,我曾在全县优质课比赛中观摩了五位教师的课,参赛的五位教师同教一篇课文《秋浦歌》,他们都能够积极引导学生投入到对课文的理解与背诵之中,把该学的生字学会了,该品味的字词品味了,该朗读的朗读了,该背的背诵了,这些内容可以通过量化测评,因此属于显效。学生在教师的引导下不知不觉地进入“炉火照天地”的壮观场面,体会到“红星乱紫烟”的危险、“赧郎明月夜”的艰辛、“歌曲动寒川”的豪迈,用不同的表情和动作“高昂地”“响亮地”朗读课文,反映出了他们对古诗的理解程度和自己所要表达的一种情感。
PCR 反应体系如下:10×PCR 缓冲液2.5 μL,10 mol/L dNTP 4 μL,25 mol/L MgCl24 μL,上、下游引物各1 μL,已修饰的DNA模板10 μL,Taq酶0.5 μL,去离子水补充体积至50 μL。扩增条件如下:94℃预变性 5 min;94℃ 1 min,58℃ 1 min,72℃1 min,共35个循环。同时分别选取经甲基化酶M.SssⅠ(NEB,美国)处理和未经处理的正常人外周血淋巴细胞DNA作为甲基化、非甲基化阳性对照,去离子水作空白对照。取5 μL反应产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪(BIORAD,美国)拍照分析。甲基化引物扩增出条带的样品,判定为甲基化阳性;未甲基化引物扩增出条带、甲基化引物扩增不出条带的样品,判定为甲基化阴性;2种引物均扩增出条带的样品,判定为甲基化阳性。
1.3 统计学处理
广东人吃海鲜火锅,格外讲究,火锅配以鱿鱼、海螺肉、鸡肉、牛肉、墨鱼、牛百叶、海参等生料,再加上蔬菜和佐料。吃时先将各种海鲜依次倒入没油的清汤里,煮熟后捞到各人碗中,然后再倒入鸡肉、牛肉等。吃完肉类,再倒入香菇、青菜等清口,鲜而不腻,味美无比。
2 结果
2.1 患者总体病理分期及组织学类型
结合血清SCC水平、组织RASSF1A甲基化阳性率对NSCLC患者的术后转移判定的ROC曲线的坐标点,血清SCC水平≥4.05 ng/mL预测NSCLC患者发生转移的敏感性和特异性分别为42.3%和 96.8%,约登(Youden)指数为 0.391;RASSF1A甲基化阳性预测NSCLC患者发生转移的敏感性和特异性分别为73.1%和83.9%,Youden指数为0.569。以血清SCC、组织RASSF1A甲基化水平越高,发生转移的风险越高进行危险分层。将血清SCC为4.05 ng/mL、组织RASSF1A发生甲基化(赋值为1)作为危险分层界值绘制Kaplan⁃Meier生存曲线,将入选的NSCLC患者分为高危组(血清SCC水平≥4.05 ng/mL和/或组织RASSF1A发生甲基化,共24例)、低危组(血清SCC水平<4.05 ng/mL和/或组织RASSF1A未发生甲基化,共33例)。Log Rank(Mantel⁃Cox)检验显示,高危组与低危组患者生存时间差别具有统计学意义(P=0.011,P<0.05),见图2。
表1 患者总体病理分期及组织学类型 Table 1 The overall pathological stage and histological type of the patient
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/472388fa7b113cd0c4e0700304e9a195.png)
表中的数据,分子为转移病例数,分母为对应分期及组织类型病例数(包含了转移病例数和未转移病例数之和),括号内为各相应组织类型病例数占对应分期总病例数的百分比。
病理分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期总计细支气管肺泡癌0/2(9.5%)0/1(5.3%)1/1(5.9%)1/4(7%)腺癌0/9(42.9%)5/7(36.8%)6/6(35.3%)11/22(38.6%)鳞癌0/8(38.1%)4/8(42.1%)8/8(47.1%)12/24(42.1%)大细胞癌0/1(4.8%)0/2(10.5%)1/1(5.9%)1/4(7%)腺鳞癌0/1(4.8%)0/1(5.3%)1/1(5.9%)1/3(5.3%)总计0/21 9/19 17/17 26/57
2.2 不同分组患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率比较
这场虚拟的晚餐极大地刺激了高潮的味蕾,他胃口大开,吃得肠满肚圆。高潮把最后的一枚花生米送进嘴里后,打了一个饱嗝,问“诗的妾”:老婆,你那边吃的什么?
根据出院后12个月NSCLC患者随访的转移情况,绘制血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率对NSCLC患者术后转移判定的ROC曲线,血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率曲线下面积分别为0.681、0.785、0.647,检验P值分别为0.019、0.000、0.058。以上结果表明血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率面积有统计学意义,血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率均符合预测NSCLC术后转移的条件,见图1。
2.3 血清SCC水平、组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率评估患者术后转移的价值
近年来对桑椹菌核病的研究集中在病原菌鉴定,田间流行规律调查,农业、化学防治及潜在生防菌株筛选方面[7,11-13],无菌核形成相关机理的报道。本试验根据已报道与核盘菌菌核形成相关的Smkl氨基酸保守序列设计简并引物,克隆桑椹缩小型菌核病病菌的丝裂原活化蛋白激酶编码基因 (mitogen-activated protein kinases from Scleromitrula shiraiana,Mmk1),初步揭示其菌核形成分子机理,以期为开发高效专一性杀菌剂,切断菌核病的病害循环提供理论依据,为病害防控提供新的思路和线索。
表2 不同分组患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率比较 Table 2 Comparison of preoperative serum SCC level,positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma among different groups
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/c7b1b33c22c402a1e134bb1de0df2f20.png)
分组 术前血清SCC平均值(x±s,ng/mL)Ⅰ期(n=21)Ⅱ期(n=19)Ⅲ期(n=17)F值或χ2值P值鳞癌(n=27)非鳞癌(n=30)t值或χ2值P值未转移(n=31)转移(n=26)t值或χ2值P值2.26±1.19 3.22±1.92 3.94±2.85 3.253 0.046 4.58±2.18 1.73±0.67-6.812 0.000 2.31±1.1 4±2.65-3.04 0.002术后组织RASSF1A甲基化阳性率(%)28.57 31.58 70.59 8.100 0.017 48.15 36.67 0.039 0.843 16.13 73.08 18.812 0.000术前血浆RASSF1A甲基化阳性率(%)19.05 21.05 41.18 2.780 0.249 37.04 16.67 1.208 0.205 12.90 42.31 6.305 0.012
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/7fb0a3140162a32948c3dd2c340076f3.png)
图1 血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率预测NSCLC术后转移的ROC曲线 Figure 1 The ROC curves of serum SCC level,positive rate of RASSF1A methylation in postoperative tissue and preoperative plasma that used to predict NSCLC postoperative metastasis
2.4 生存曲线分析
57例NSCLC患者,总体病理分期及组织学类型分布见表1。其中26例(45.6%)因肺癌转移再次入院,为转移组。其余31例未发生转移为未转移组。
比较不同病理分期患者术前血清SCC、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率,Ⅲ期均高于Ⅱ期、Ⅱ期高于Ⅰ期,3组间术前血清SCC水平、术后组织RASSF1A甲基化阳性率差异均有统计学意义(P<0.05),术前血浆RASSF1A甲基化阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。鳞癌(包括鳞癌和腺鳞癌)患者术前血清SCC水平高于非鳞癌患者,差异有统计学意义(P<0.05),组织、术前血浆RASSF1A甲基化阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。发生转移的患者术前血清SCC水平、术后组织和术前血浆RASSF1A甲基化阳性率均高于未发生转移的患者,差异均有统计学意义(P<0.05),具体数据见表2。
3 讨论
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/87a74ee38a47d1914b854a525dcbec1f.png)
图2 不同危险分层的Kaplan⁃Meier生存曲线 Figure 2 Kaplan⁃Meier survival curves of different risk stratification
由于非小细胞肺癌易复发和转移,因此判断临床病情的严重程度、危险分层和术后转移给患者带来了很大的困难。在非小细胞肺癌的研究中,主要依靠病理分期、生物标志物和患者的临床特征来预测预后。寻找非小细胞肺癌转移标志物是肺癌研究领域的热点之一。近年来,CA125、CYFRA21⁃1、CEA等生物标志物已被确定在非小细胞肺癌的发生和发展中有重要作用。同时,还为非小细胞肺癌的诊断、危险分层、疗效评价和术后转移提供了有力的支持。
在本研究中使用的SCC是一种常用的肿瘤标志物,其在子宫、肺、头部和颈部等鳞癌中均有表达。大量的临床研究表明,检测SCC有助于判断非小细胞肺癌患者的术后转移,尤其是在肺鳞状细胞癌患者中[4⁃6]。在非小细胞肺癌患者中,血清SCC的升高可能提示转移或预后差。本研究结果显示,越后期的病理分期,术前血清SCC水平越高,可以辅助病理分期的诊断;同时,鳞癌患者SCC水平可以作为肺鳞状细胞癌的鉴别诊断指标;高水平SCC转移率较高与国内外SCC对于NSCLC术后转移评价的研究结果一致[4⁃6]。
在NSCLC标志物的研究中,通过检测可预测化疗疗效和预后的分子标记物,可以识别出可从化疗中受益的早期患者。RASSF1A是一个抑癌基因,多项研究表明其启动子区异常的高甲基化会导致其丧失抑癌功能[8⁃9]。另外,有研究指出,肿瘤细胞在坏死的过程中,可释放DNA进入循环血中,与相应的原发肿瘤细胞在分子层面的变异相一致[10⁃11]。但是 NSCLC 的基因甲基化研究仅局限于组织方面,仅有少数检测循环血中的研究[12]。针对河北地区人群的相关性研究表明,血浆中甲基化RASSF1A基因的检出率与NSCLC的分化程度有关[13]。也有研究指出,肺癌组织和血浆RASSF1A基因甲基化检出率与患者分化程度、淋巴结转移有关[14],非小细胞肺癌患者的淋巴结有更高比例的RASSF1A基因甲基化检出率[15]。这与本研究的结果具有一致性。本实验通过检测NSCLC患者术后组织和血浆RASSF1A甲基化水平,并对患者进行12个月的随访,随访期间发生转移的患者组织和血浆RASSF1A甲基化阳性率均高于未发生转移的患者,差异有统计学意义(P<0.05)。这表明RASSF1A甲基化与NSCLC患者术后转移相关,有望作为NSCLC术后转移预测的新型标志物。另外,病理分期越晚,组织RASSF1A甲基化阳性率越高,可作为病理分期的辅助标志物[16⁃17]。
本文研究结果表明,血清SCC和组织RASSF1A甲基化阳性率均可作为NSCLC术后转移的标志物,但分别使用的正确诊断指数(约登指数)并不高。Log Rank(Mantel⁃Cox)检验显示,血清SCC、组织RASSF1A甲基化水平高与水平低的患者生存时间差异具有统计学意义(P<0.05)。血清 SCC、组织 RASSF1A甲基化水平都与NSCLC的危险分层有关,且水平越高发生转移事件的风险越大。综上所述,血清SCC、血浆和组织RASSF1A甲基化水平在NSCLC患者危险分层及术后转移评估中有一定的临床意义。
本研究数据仅限于龙岩地区,样本量不够大;此外,本研究以无转移的NSCLC患者为对照组,未建立良性肺病对照组、小细胞肺癌对照组,随访持续时间仅为一年。以上是本研究的不足之处。因不同的标志物有各自独特的生物学特性和代谢过程,在NSCLC的发展过程中协同或单独发挥作用,如果能对NSCLC患者血清SCC、血浆RASSF1A甲基化水平联合并持续检测,同时结合影像学等其他诊断手段,将有利于对NSCLC术后转移不良患者的监测和干预,对延缓病情进展、延长患者的生存时间有重要意义。
参考文献
[1]Su Y,Fang HB,Jiang F.Integrating DNA methyla⁃tion and microRNA biomarkers in sputum for lung can⁃cer detection[J].Clin Epigenetics,2016,8(1):109.
[2]王柳倩,马为.肿瘤标志物在肺癌的早期诊断及预后评估中的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,22(12):3004⁃3007.
[3]亢春彦,周慧聪,汤少鹏,等.血浆中检测FHIT、p16、MGMT和RASSF1A基因甲基化在肺癌诊断中的价值[J]. 肿瘤,2011,31(8):729⁃734.
[4]时君,徐风亮,许祯杰,等.血清肿瘤标记物联合动态检测在肺癌诊断和监控治疗中的应用[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(12):48⁃50.
[5]Fiala O,Pesek M,Finek J,et al.Prognostic signifi⁃cance of serum tumor markers in patients with ad⁃vanced⁃stage NSCLC treated with pemetrexed⁃based chemotherapy[J].Anticancer Res,2016,36(36):461⁃466.
[6]Jiang R,Wang X,Li K.Predictive and prognostic val⁃ue of preoperative serum tumor markers is EGFR muta⁃tion⁃specific in resectable non⁃small⁃cell lung cancer[J].Oncotarget,2016,7(18):26823⁃26836.
[7]Ettinger D,Borghaei H,Akerley W.NCCN clinical practice guidelines in oncology ⁃non⁃small cell lung cancer[J].J Natl Compr Canc Netw,2015,2(2):94⁃123.
[8]Pastuszak⁃Lewandoska D,Kordiak J,Migdalska⁃Sęk M,et al.Quantitative analysis of mRNA expression levels and DNA methylation profiles of three neighbor⁃ing genes:FUS1,NPRL2/G21 and RASSF1A in non⁃small cell lung cancer patients[J].Respir Res,2015,16(1):1⁃13.
[9]Liu B,Song J,Luan J,et al.Promoter methylation status of tumor suppressor genes and inhibition of ex⁃pression of DNA methyltransferase 1 in non⁃small cell lung cancer[J].Exp Biol Med(Maywood),2016,241(14):1531⁃1539.
[10] 戴五敏,韩晓红,石远凯.循环肿瘤DNA在肿瘤临床应用中的进展[J].中国新药杂志,2016,25(21):2456⁃2461.
[11] 徐婷,徐国宾,贾淑芹,等.循环肿瘤DNA检测在恶性肿瘤诊治中的应用进展与问题思考[J].临床检验杂志,2017,35(2):81⁃88.
[12] Ma Y,Bai Y,Mao H,et al.A panel of promoter methylation markers for invasive and noninvasive early detection of NSCLC using a quantum dots⁃based FRET approach[J].Biosens Bioelectron,2016,85:641 ⁃648.
[13] 曹丽,孙阳阳,曹若琼,等.非小细胞肺癌患者血浆RUNX3、RASSF1A、3⁃OST⁃2、DAPK、PTPRO基因甲基化状态观察[J]. 山东医药,2016,56(43):84⁃87.
[14] 王培培,张翠英.内蒙古地区RASSF 1A、P16、DAPK、RUNX3基因甲基化在非小细胞肺癌中的研究[J]. 内蒙古医科大学学报,2016,38(2):98⁃102.
[15] Millares L,Serra M,Andreo F,et al.Assessment of methylation status of locoregional lymph nodes in lung cancer using EBUS ⁃NA[J].Clin Exp Metastasis,2015,32(7):637.
[16] Monsó E,Montuenga LM,Sánchez de Cos J,et al.Biological marker analysis as part of the CIBERES⁃RTIC cancer⁃SEPAR strategic project on lung cancer[J].Arch Bronconeumol,2015,51(9):462⁃467.
[17] Millares L,Serra M,Andreo F,et al.Assessment of methylation status of locoregional lymph nodes in lung cancer using EBUS ⁃NA[J].Clin Exp Metastasis,2015,32(7):637⁃646.