PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中的表达及机制研究
卵巢癌是引起女性死亡的最常见癌症[1],其病因仍不明确[2]。虽然近年来肿瘤细胞减灭术及联合化疗使其预后有所改善,但其5年存活率仍停留在30%左右。随着分子生物学及相关学科的发展,基因治疗在癌症治疗中体现出巨大潜力,而找到关键基因则成为首要问题。PAKs(p21-ctivated kinases )是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,它存在于肿瘤形成的多种信号通路中。已有研究显示,PAK4能促进卵巢癌的增殖、转移、侵袭[4],但其具体机制并不十分明确。因血管内皮生长因子(VEGF)、细胞周期素D1( CCND1)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)分别为肿瘤组织中促血管形成、促细胞周期、抑制凋亡作用的重要蛋白,且有文献报道,在卵巢癌中PAK4可经过ep38/VEGF通路促进卵巢癌细胞的转移和侵袭[5];PAK1能够上调CCND1的转录活动,PAK4也具有类似作用[6]。本研究将探讨PAK4与VEGF、CCND1、Bcl-2在卵巢癌中的表达并进行相关性分析,预测其可能作用机制。
1 对象与方法
1.1 研究对象 将我院2011年1月~2015年12月收治的185例患者根据病理分型分为对应4组,即手术治疗的50例上皮性浆液性卵巢癌患者,平均58岁(43~75岁) ,术前均无放疗、化疗或内分泌治疗病史;50 例正常卵巢组织标本取自因良性疾病行卵巢切除术患者,平均43岁(25~52 岁) ;50 例浆液性良性卵巢肿瘤标本,平均41岁(27~53岁) ;35例交界性浆液性卵巢肿瘤标本,平均42岁(32~55岁) 。4组患者年龄经比较,差异无统计学意义(P>0.05)。以上所有标本均经HE染色后,通过至少2名病理医师检查证实,手术病理分期标准为2009年国际妇产科联合会(FIGO)卵巢癌分期。
1.2 免疫组化检测 标本经4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,制备成4μm切片,分别行HE及免疫组化染色。免疫组化试剂盒购自上海明睿生物技术公司,兔抗人PAK4多克隆抗体、兔抗人VEGF单克隆抗体、兔抗人CCND1单克隆抗体及兔抗人Bcl-2单克隆抗体均购自美国Abcam公司,均为1:100稀释。切片经脱蜡、梯度酒精水化、3%过氧化氢-甲醇封闭内源性过氧化物酶、微波加热抗原修复、孵育一抗、二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色。PAK4阳性染色为棕黄色颗粒,主要表达于细胞质;CCND1蛋白为棕褐色或棕黄色颗粒,表达于细胞核;VEGF、BCL-2阳性染色为棕黄色颗粒,蛋白定位于细胞浆;阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。采用双盲法统计实验结果,采用半定量积分法[7]分别对每个视野的阳性细胞率及阳性细胞染色强度记分,根据两项得分乘积确定其阳性强度。阳性细胞百分数: <5%记0分;5%~记1分;25%~记2分;50%~记3分;75%~100%记4分。染色强度: (-) 记0 分;(+) 记 1 分;() 记2分;(
) 记3分。免疫组化阳性强度评分=阳性细胞率×染色强度,得分范围为0~12分,并将上皮性浆液性卵巢癌组织中0~6分定义为低表达组,7~12分定义为高表达组。
1.3 统计学方法 采用SPSS 17. 0统计学软件进行数据处理,计量资料以表示。组间差异及组间相关性分析分别采用One-Way ANOVA单因素方差分析和Spearman相关性分析,计数资料的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PAK4、CCND1、VEGF及Bcl-2在不同组织中的表达 PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中的表达高于其他三组(F=48.142,P<0.001 ),见图1(a,b,c,d)、表1。CCND1(F=51.270,P<0.001 )、VEGF(F=56.692,P<0.001 )、及BCL-2(F=54.540,P<0.001 )在上皮性浆液性卵巢癌中的表达高于其他三组,见表1~4。
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/53a76a6969e2d07fe1cbe2eb0d773ed3.png)
图1 PAK4在4组中的表达情况及PAK4、VEGF、CCND1、Bcl-2在浆液性卵巢癌中的表达情况(SP,400×)
a: PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中的表达情况;b: PAK4在交界性卵巢肿瘤中的表达情况;c: PAK4在浆液性良性卵巢肿瘤中的表达情况;d: PAK4在正常卵巢组织中的表达情况。f: VEGF在上皮性浆液性卵巢癌中的表达情况;g: CCND在上皮性浆液性卵巢癌中的表达情况;h: Bcl-2在上皮性浆液性卵巢癌中的表达情况。
表1 不同组织中PAK4的表达
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/dbebada443793f7180182b6e13fc68ab.png)
组别nPAK4FP正常卵巢组织503.02±2.6648.142<0.001浆液性良性卵巢肿瘤504.00±2.80交界性卵巢肿瘤355.03±2.18上皮性浆液性卵巢癌509.06±2.96
表2 不同组织中VEGF的表达
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/ebfbc0a260c5645f252cf818b75064c3.png)
组别nVEGFFP正常卵巢组织503.30±2.6556.692<0.001浆液性良性卵巢肿瘤504.22±2.56交界性卵巢肿瘤355.49±2.01上皮性浆液性卵巢癌509.38±2.64
表3 不同组织中CCND1的表达
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/fb52d4f4c1087249c795f0933388aef0.png)
组别nCCND1FP正常卵巢组织503.00±2.7351.270<0.001浆液性良性卵巢肿瘤503.64±2.77交界性卵巢肿瘤355.03±2.43上皮性浆液性卵巢癌509.14±2.86
表4 不同组织中Bcl-2 的表达
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/5500496778b6fd619779bef789f096b9.png)
组别nBcl⁃2FP正常卵巢组织502.98±2.8054.540<0.001浆液性良性卵巢肿瘤503.72±2.79交界性卵巢肿瘤355.37±1.97上皮性浆液性卵巢癌509.20±2.79
2.2 PAK4的表达与上皮性浆液性卵巢癌患者临床及病理特征的关系 PAK4在组织学低分化(χ2=21.435,P<0.001 )、有淋巴结转移(χ2=21.542,P<0.001)及分期较晚的组织中(χ2=32.766,P<0.001 )表达率较高,而不同年龄间高表达率无明显差异(χ2=0.272,P=0.713 ),见表5。
表5 上皮性浆液性卵巢癌患者临床病理特征与PAK4表达的关系
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/2fb9641a59ea8f01ebda5e7f29450bcf.png)
临床及病理特征nPAK4表达计数高表达低表达χ2P年龄<5011740.2720.713≥50392811分化程度高91821.435<0.001中1064低31283临床分期Ⅰ+Ⅱ1521332.766<0.001Ⅲ+Ⅳ35332淋巴结转移无1961321.542<0.001有31292
2.3 上皮性浆液性卵巢癌中VEGF、CCND1、及Bcl-2表达与PAK4的相关性分析 见图1(f,g,h)。PAK4与VEGF表达呈正相关(r=0.764,P<0.001 ),见表6。PAK4与Bcl-2表达呈正相关(r=0.706,P<0.001 ),见表7。 PAK4与CCND1表达呈正相关(r=0.601,P<0.001 ),见表8。
表6 上皮性浆液性卵巢癌中PAK4与VEGF的相关性分析
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/b7168ad155ef0ce3aab08971c6ac88b4.png)
PAK4VEGF高表达低表达rP高表达3500.764<0.001低表达510
表7 上皮性浆液性卵巢癌中PAK4与Bcl-2的相关性分析
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/e8bf437a1b1556c1a6255efdab420bea.png)
PAK4Bcl⁃2高表达低表达rP高表达3410.706<0.001低表达510
表8 上皮性浆液性卵巢癌中PAK4与CCND1的相关性分析
![](https://qkk.lw71.com/uploads/image/2018/02/07044b872d3ff1f100d858544f9e9aec.png)
PAK4CCND1高表达低表达rP高表达3320.601<0.001低表达69
3 讨论
根据序列和化学结构,6种哺乳动物PAKs可以分为两组:第一组(PAK1-3)和第二组(PAK4-6)。第二组中的PAK4在肺、卵巢、结肠、乳腺、前列腺等多种恶性肿瘤细胞中表达升高或活性增强[8~10],PAK4对胃癌也具有诊断意义[11]。本实验应用免疫组化技术对PAK4在卵巢癌中的表达情况进行研究,图1(a,b,c,d)可直观看出,PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中的表达高于其在交界性浆液性卵巢肿瘤、浆液性良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达,对免疫组化结果进行半定量分析后,统计学结果显示,PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中的表达显著高于其在交界性浆液性卵巢肿瘤、浆液性良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达,这表明PAK4可能在上皮性浆液性卵巢癌的发生、发展中起重要作用。通过进一步分析我们发现,PAK4在组织学高分化(χ2=21.435,P=0.000)、有淋巴结转移(χ2=28.741,P=0.000)及分期较晚的组织中(χ2=32.766,P=0.000)高表达率较高 ,而不同年龄间高表达率无明显差异(χ2=0.022,P=0.713)。PAK4表达水平与淋巴结转移、肿瘤分期、病理分级等临床病理参数呈正相关,而这些参数均与患者的预后密切相关。这表明 PAK4表达和活性随着卵巢癌的恶性进展逐渐升高,PAK4可能参与了卵巢癌发生、发展的过程。已有研究显示,PAK4蛋白在卵巢癌组织中过表达并能促进卵巢癌的增殖、转移、侵袭,且卵巢癌中PAK4 表达较高预示了患者预后不良[4]。
VEGF、CCND1、Bcl-2分别为肿瘤组织中促血管形成、促细胞周期、抑制细胞凋亡的重要蛋白。本实验通过免疫组化染色发现PAK4、VEGF、CCND1、Bcl-2四种蛋白在人卵巢癌组织中均呈高表达,图1(f,g,h)。在VEGF被抑制的卵巢癌细胞中,其增殖也受到抑制[12];VEGF对卵巢癌的病理高通透性及腹腔积液形成起到重要作用[13]。这说明VEGF能够促进卵巢癌细胞的增殖和转移。另有研究显示,Bcl-2表达水平和卵巢癌的顺铂敏感性相关[14];Bcl-2蛋白表达在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中起重要作用[15]。CCND1基因的扩增在卵巢肿瘤的发生、发展中起重要作用,且与卵巢癌的病理分级、临床分期及癌组织的转移有关[16]。以往研究结果说明VEGF、Bcl-2、CCND1三者的表达水平与卵巢癌的恶性进展也存在相关性。为探究PAK4在上皮性浆液性卵巢癌中可能的作用机制,本实验同时检测了CCND1、VEGF、Bcl-2在上皮性浆液性卵巢癌中的表达情况。实验结果显示CCND1、VEGF、Bcl-2在上皮性浆液性卵巢癌中均呈高表达。有研究报道,在卵巢癌中PAK4可通过ep38/VEGF通路促进卵巢癌细胞的转移和侵袭[5];PAK2和PAK4基金敲除的小鼠发生致命的包括严重心血管畸形在内的广泛血管形成缺陷[6]。这说明PAK4在血管形成中起着重要作用,在恶性肿瘤中PAK4可能通过促进VEGF的表达达到促进血管形成的作用。本实验卵巢癌中PAK4与VEGF表达呈正相关也进一步说明了PAK4对VEGF的可能促进作用。PAK4-6可能直接磷酸化Bcl-2相关细胞死亡激动剂(BAD)[17]。且PAK4过表达的胰腺癌中Bcl-2也出现过表达[18],沉默PAK4也会导致Bcl-2等表达减少[19]。这些都说明PAK4与Bcl-2的表达有一定的相关性。本实验卵巢癌中PAK4与Bcl-2表达呈正相关也提示,PAK4对Bcl-2的可能促进作用。另有研究显示,PAK4的沉默会导致CCND1减少,进而抑制G1期胰腺癌细胞生长[20];抑制PAK4蛋白会降低CCND1的ERα靶向基因的表达[21]。因此,癌细胞中PAK4与CCND1的表达可能存在相关性。本实验卵巢癌中PAK4与CCND1表达呈正相关进一步说明了两者表达的相关性。VEGF、CCND1、Bcl-2分别为肿瘤组织中促血管形成、促细胞周期、抑制细胞凋亡的重要蛋白,通过以往研究结果我们发现三者的表达水平与卵巢癌的恶性进展存在相关性。
总之, PAK4可能通过促进VEGF、CCND1、及Bcl-2的表达发挥促卵巢癌恶性进展的作用。
潮湿或者是霉菌和真菌等因素的存在,在这里显然是相关的,室内空气的化学成分也是如此。在城市地区,室内VOCs的水平通常比室外高出2~5倍。
参考文献
[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90
[2] Mahmood FM,Kadhim HS,Al Khuzaee LRM.Detection of human papillomavirus-16 E6-Oncoprotein in epithelial ovarian tumors samples of iraqi patients[J].Jundishapur J Microbiol,2014,7(9):e11945
[3] Lambertini M,Ginsburg ES,Partridge AH.Update on fertility perservation in young woman undergoing breast cancer and ovarian cancer therapy[J].Breast cancer,2015,27(00):1-10
[4] Siu MKY,Chan HY,Kong DS,et al.p21-activated kinase 4 regulates ovarian cancer cell proliferation, migration, and invasion and contributes to poor prognosis in patients[J].Pans,2010,107(43):18622-18627
[5] Siu MKY,Kong DSH,Ngai SYP,et al.p21-activated kinases1,2 and 4 in endometrial cancers:effectson clinical outcomes and cell proliferation[J].PLoS ONE,2015,10(7):e0133467
[6] Rudu M,Semenova G,Kosoff R,et al.Pak signaling in the development and progression of cancer[J].Nat Rev Cancer,2014,14(1):13-25
[7] 陆 雯,苏 涛,张慧娟,等.Pak4在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义[J].现代妇产科进展,2016,25(2):97-99
[8] Huang Z,Traugh JA,Bishop JM.Negative control of the myc protein by the stress-responsive kinase Pak2[J].Mol Cell Biol,2004,24:1582-1594
[9] Bi YQ,Tian MZ,Le JH,et al.Study on the expression of PAK4 and P54 protein in breast cancer[J].World Journal of Surgical Oncology,2016,14:160
[10] Huang Z,Ling J,Traugh JA.Localization of p21-activated protein kinase gamma-PAK/Pak2 in the endoplasmic reticulum is required for induction of cytostasis[J].The Journal of Biological Chemistry,2003,278:13101-13109
[11] Kobayashi K,Inokuchi M,Takagi Y,et al.Prognostic significance of PAK4 expression in gastric cancer[J].Clin Pathol,2015:1-6
[12] Dai SY,Liu JJ,Sun XF,et al.Ganoferma lucidum inhibits proliferation of human ovarian cells by suppressing VEGF expression and up-regulating the expression of connexin 43[J].Complementary and Alternative Medicine,2014,14:434
[13] Bekes I,Friedl TWP,Köhler T,et al.Does VEGF facilitate local tumor growth and spread into the abdominal cavity by suppressing endothelial cell adhesion,thus increasing vascular peritoneal permeability followed by ascites production in ovarian cancer[J].Molecular Cancer,2016,15:13
[14] Wang HX,Zhang ZF,Wei XP,et al.Small-molecule inhibitor of Bcl-2(TW-37 suppresses growth and enhances cisplatin-induced apoptosis in ovarian cancer cells[J].Journal of Ovarian Research,2015,8:3
[15] 万红英,刘 侃,谢 斌,等.WT1,Bcl-2,Ki-67蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及其相关性研究[J].江西医药,2015,50(1):16-19
[16] 张志磊,鲁 强,马德花,等.FISH技术检测卵巢上皮性肿瘤组织CCND1表达及临床意义[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(22):1789-1792
[17] Ha BH,Morse EW,Turk BE,et al.Signaling,regulation and specificity of the typeII p21-activated kinases[J].The Journal of Biological Chemistry,2015,290(21):12975-12983
[18] Tyagi N,Marimuthu S,Bhardwaj A,et al.p-21 activated kinase 4 (PAK4) maintains stem cell-like phenotypes in pancreatic cancer cells through activation of STAT3 signaling[J].Cancer Letters,2016,370:260-267
[19] Tyagi N,Bhardwaj A,Singh AP,et al.p-21 activated kinase 4 promotes proliferation and survival of pancreatic cancer cells through AKT- and ERK-dependent activation of NF-κB pathway[J].Oncotarget,2014,5(18):8778-8789
[20] Shao YG,Ning K,Li F.Group Ⅱ p21-activated kinases as therapeutic targets in gastrointestinal cancer[J].World J Gastroenterol,2016,22(3):1224-1235
[21] Zhuang T,Zhu J,Li ZL,et al.p21-activated kinase group II small compound inhibitor GNE2861 perturbs estrogen receptor alpha signaling and restores tamoxifen-sensitivity in breast cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(41):43853-43868
New Media to Bridge the Gap between Migrant Workers and More Matched-up Jobs: An Investigation and Analysis Based on Four Cities in the Yangtze River Delta Region